Komplexe Partitionsstrukturen können durch Gleiten und Verbrückung von ParB-Dimeren entstehen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4567 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In vielen Bakterien erfordert die Chromosomensegregation die Assoziation von ParB mit der parS-haltigen zentromeren Region, um den Partitionskomplex zu bilden. Die Struktur und Bildung dieses Komplexes war jedoch unklar. Kürzlich haben Studien gezeigt, dass die CTP-Bindung es ParB-Dimeren ermöglicht, entlang der DNA zu gleiten und die zentromere Region durch die Bildung von DNA-Brücken zu kondensieren. Mithilfe von semiflexiblen Polymersimulationen zeigen wir, dass diese Eigenschaften die Bildung von Partitionskomplexen erklären können. Transiente ParB-Brücken organisieren DNA je nach Brückenlebensdauer in kugelförmige Zustände oder Haarnadel- und Helixstrukturen, während separate Simulationen zeigen, dass das ParB-Gleiten das bei Caulobacter crescentus beobachtete Bindungsprofil mit mehreren Spitzen reproduziert. Durch die Kombination von Gleiten und Überbrücken in einem einheitlichen Modell stellen wir fest, dass kurzlebige ParB-Brücken das Gleiten nicht behindern und sowohl das Bindungsprofil als auch die Kondensation des Nukleoproteinkomplexes reproduzieren können. Insgesamt klärt unser Modell den Mechanismus der Bildung von Partitionskomplexen auf und sagt seine Feinstruktur voraus.

Eine getreue Chromosomentrennung ist für die effiziente Replikation von Zellen unerlässlich. Hierzu nutzen bakterielle Chromosomen und Low-Copy-Plasmide aktive Partitionierungssysteme, wobei das ParABS-System eines der am weitesten verbreiteten ist1,2,3. Dieses System besteht aus drei Komponenten: zentromerähnlichen parS-Sequenzen und zwei Proteinen, ParB, das Dimere bildet, die spezifisch an die parS-Sequenz binden, und ParA, einer ATPase, deren Aktivität durch ParB4,5 stimuliert wird.

ParB breitet sich auf mehrere Kilobasen DNA rund um die parS-Stellen aus, die bei Bakterien in der Nähe des Replikationsursprungs konzentriert sind6. Diese Ausbreitung ist für das Funktionieren dieser Systeme unerlässlich, obwohl der Grad der Ausbreitung zwischen den Systemen erheblich variiert7,8,9,10,11,12,13. In jedem Fall wird angenommen, dass es sich dabei um einen Nukleoproteinkomplex, den Partitionskomplex, handelt, der im Fluoreszenzmikroskop deutlich sichtbar ist. Ursprünglich wurde angenommen, dass die Ausbreitung auf die Bildung eines Nukleoproteinfilaments zurückzuführen ist, das sich von der parS-Stelle aus erstreckt7,8,14. Später zeigte sich jedoch, dass es zu wenige ParB-Proteine ​​gibt, um so große Strukturen zu bilden10. Stattdessen wurde in vitro festgestellt, dass ParB DNA durch unspezifische DNA-Bindung und die Bildung von Proteinbrücken kondensiert10,15,16,17,18,19.

Diese Ergebnisse motivierten Modellstudien zur Bildung von Partitionskomplexen. Insbesondere schlug das Ausbreitungs- und Überbrückungsmodell vor, dass sich der Partitionskomplex durch eine Kombination aus Überbrückung über große Entfernungen (3D) und Wechselwirkungen mit nahen Nachbarn über kurze Entfernungen (1D) bildet20. Später wurde jedoch argumentiert, dass dieses Modell nicht mit dem Bindungsprofil von ParB aus F-Plasmid11 kompatibel sei. Stattdessen wurde vorgeschlagen, dass das beobachtete Profil auf den räumlichen Käfig von ParB um die keimbildende parS-Stelle, auf unspezifische und vorübergehende Wechselwirkungen und auf die polymere Natur der DNA zurückzuführen ist11,21,22. Dieses Modell kann auch als Weak-Spreading-Grenze des Spreading- und Bridging-Modells23 verstanden werden.

Kürzlich wurde gezeigt, dass ParB eine parS-abhängige CTPase-Aktivität aufweist, die für die korrekte Bildung und Dynamik des Partitionskomplexes erforderlich ist13,24,25,26,27,28. Es wurde gezeigt, dass CTP-gebundene ParB-Dimere an parS-Stellen auf die DNA laden und diese umschließen und anschließend entlang des DNA-Strangs gleiten, bevor sie schließlich dissoziieren. In vitro wurde auch gezeigt, dass die CTP-Bindung die ParB-Verbrückung bei physiologischen Konzentrationen (viel niedriger als in Abwesenheit von CTP10,15 erforderlich) ermöglicht und zu einer effizienten DNA-Kondensation führt29,30. Diese Ergebnisse verändern unser Verständnis der Bildung des Partitionskomplexes grundlegend und legen nahe, dass die vorherigen Modelle neu bewertet werden müssen. Insbesondere hat noch keine Modellierungsstudie einen einheitlichen Rahmen für das Gleiten und Überbrücken von ParB-Dimeren bereitgestellt. Das Gleiten von ParB kann auch für chromosomale ParABS-Systeme von zusätzlicher Bedeutung sein, die typischerweise mehrere genomisch getrennte parS-Stellen und infolgedessen mehr als einen Peak im ParB-Bindungsprofil aufweisen9,10,12,13,21,31,32,33, 34, weisen jedoch in Wildtyp-Zellen einen einzigen sichtbaren Partitionskomplex pro Ursprung auf10,35.

Hier untersuchen wir die Rolle des ParB-Gleitens und der Brückenbildung bei der Bildung von Partitionskomplexen mithilfe von semiflexiblen Polymer- und Reaktions-Diffusions-Simulationen. Wir zeigen zunächst, dass unterschiedliche Lebensdauern der ParB-Brücke zu deutlich unterschiedlichen Polymerkonformationen führen. Anschließend untersuchen wir das Kurzlebensregime, in dem sich unterschiedliche DNA-Strukturen (Haarnadeln und Helices) bilden, und zeigen, wie diese Strukturen zur Kondensation von ParB-beschichteter DNA führen. Anschließend verwenden wir stochastische Simulationen, um zu zeigen, dass das ParB-Gleiten die experimentell beobachtete ParB-Verteilung mit mehreren Spitzen reproduzieren kann, und untersuchen die Auswirkungen von Straßensperren auf das Gleiten. Schließlich kombinieren wir ParB-Brückenbildung und -Gleiten in Simulationen mit gekoppeltem Polymer/Reaktionsdiffusion außerhalb des Gleichgewichts und zeigen, dass Brückenbildung das ParB-Gleiten bei ausreichend kurzen Brückenlebensdauern nicht hemmt. Insgesamt unterstützt unsere Arbeit ein neues Modell der Bildung von Partitionskomplexen, bei dem ParB-Dimere an parS-Stellen auf die DNA geladen werden, bevor sie diffusiv entlang der DNA gleiten. Genomisch entfernte, aber räumlich nahe gelegene ParB-Dimere interagieren, um vorübergehende Brücken zu bilden, die die DNA durch die Bildung von Haarnadel- und Helixstrukturen organisieren. Wir spekulieren, dass diese Strukturen die zusätzliche Funktion von ParB erleichtern, SMC-Komplexe (Structural Maintenance of Chromosome) auf das Chromosom zu laden.

Um ein realistisches Modell der Bildung von Partitionskomplexen zu erhalten, verwenden wir ein halbflexibles Gitterpolymermodell der 10 kb großen zentromeren Region von C. crescentus, in dem jedes Monomer 20 bp entspricht, dem ungefähren Fußabdruck eines ParB-Dimers28,36 ( Abb. 1a). Die DNA wird mithilfe einer kinetischen Implementierung des BFM-Polymermodells (Bond Fluctuation Method)37 als lineare Kette modelliert. Da die DNA in diesem Maßstab steif ist, führen wir einen energetischen Aufwand für das Biegen ein, um die experimentell gemessene Persistenzlänge von lp ~ 120 bp zu erhalten (ergänzende Abbildung 1a)38. Das BFM ist dafür gut geeignet, da es einen großen Satz an Bindungswinkeln zulässt37 und daher Steifigkeit realistischer umsetzen kann als Modelle, die nur Bindungswinkel von 0∘ oder 90∘ zulassen. Der Gitterabstand entspricht 2,2 nm. Zulässige Monomerbewegungen werden mit einer Geschwindigkeit p versucht, die die grundlegende Polymerzeitskala τ = 1/p definiert, und entsprechend den entsprechenden Energiekosten akzeptiert.

a Schematische Darstellung des Polymermodells. Zwischen genomisch entfernten, räumlich benachbarten Monomeren können sich Brücken mit einer Geschwindigkeit bilden, die proportional zur ParB-Belegung an jedem Monomer ist. Die ParB-Verteilung ist in c explizit dargestellt. b Energielandschaft einer verbrückenden und entbrückenden Wechselwirkung zwischen zwei räumlich nahe beieinander liegenden Monomeren i und j. Bei der Überbrückung kommt es zu einer Gesamtänderung der Energie ΔEij. Die Beziehung zwischen den Aktivierungsenergien für die Brückenbildung (\({{\Delta }}{E}_{ij}^{b}\)) und die Brückenbildung (ΔEub) und die im Modell verwendeten Reaktionsgeschwindigkeiten werden gezeigt. Bi ist die ParB-Belegung am Monomer i und p ist die Polymerbewegungsversuchsrate, die die Polymerzeitskala τ = 1/p definiert. c Das normalisierte ParB-ChIP-Seq-Profil12 gibt die ParB-Verteilung an. parS-Sites werden durch rote Punkte dargestellt. Beachten Sie, dass die beiden parS-Standorte sehr nahe beieinander liegen. d Phasendiagramm des Systems in Bezug auf die effektive Bindungskonstante \(\frac{{k}_{b}}{{k}_{ub}}{B}^{2}=\left\langle \exp ( {{\Delta }}{E}_{ij}/{k}_{B}T)\right\rangle\), wobei B2 als Mittelwert \(\left\langle {B}_{i} {B}_{j}\right\rangle\) übernommen über alle i, j mit ∣i−j∣>1, und \(\frac{p}{{k}_{ub}}=\exp ({ {\Delta }}{E}^{ub}/{k}_{B}T)\), die relative Brückenlebensdauer (siehe Methoden). e Der mittlere ParB-gewichtete Radius für kurze und lange Brückenlebensdauern (±SD) (angezeigt durch die gestrichelten Linien in d) als Funktion der Anzahl der Brücken. Daten von 1000 Konformationen für jeden Parametersatz. Kreise geben die jeweiligen Positionen von f, g und h an, d. h. f Eine Beispielkonformation des Polymers im kugelförmigen Zustand. g Durchschnittliche Kontaktkarte am selben Ort basierend auf 1000 Konformationen. Ein Kontakt ist definiert als zwei Monomere, die innerhalb von fünf Gitterplätzen voneinander entfernt sind. h Eine beispielhafte Konformation des Polymers im strukturierten Zustand. i Durchschnittliche Kontaktkarte am gleichen Ort, sonst wie in g. Die in f, g und h untersuchten Standorte haben beide durchschnittlich etwa 85 Brücken. Äquivalente Diagramme für das spulenartige Regime, angezeigt durch den Kreis ganz links in d, sind in der ergänzenden Abbildung 1f, g dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Das Polymer wird durch ParB-induzierte Brückenbildung zwischen Monomeren eingeschränkt. Dies wird dadurch erreicht, dass zwei beliebige räumlich benachbarte, nicht benachbarte Monomere des Polymers eine Brücke mit einer Geschwindigkeit bilden können, die von ihren ParB-Belegungen Bi, Bj und einem Geschwindigkeitsparameter kb abhängt. Jedes Dimer/Monomer kann jeweils nur ein anderes Dimer/Monomer überbrücken (im Folgenden bezieht sich „Dimer“ immer auf ein ParB-Dimer und „Monomer“ auf ein Monomer des simulierten DNA-Polymers). Brücken dissoziieren zufällig mit Rate Kub und haben daher exponentiell verteilte Lebensdauern. Diese Raten hängen mit den Aktivierungsenergien für die Überbrückung und Entbrückung zusammen, deren Differenz ΔEij die zugehörige Bindungsenergie der Wechselwirkung ist (Abb. 1b). Weitere Details zum Modell finden Sie im Abschnitt Methoden.

Da ParB-Dimere entlang der DNA gleiten können, kann die Ausbreitung von ParB im gesamten Zentromerbereich zumindest im Prinzip unabhängig von einer 3D-Struktur erfolgen. Daher modellieren wir ParB-Dimere zunächst implizit, indem wir die relative Wahrscheinlichkeit der ParB-Belegung verwenden, die aus dem experimentellen Bindungsprofil (ChIP-Seq)12 erhalten wird, um die Wahrscheinlichkeit einer Brückenbildung anzugeben, wenn zwei gegebene Monomere in die Nähe kommen. Dies wird es uns ermöglichen, zunächst zu untersuchen, wie die beobachtete ParB-Genomverteilung durch Bridging die Struktur der zentromeren Region beeinflussen kann, unabhängig von der Frage der ParB-Ausbreitung. Wir werden die Kopplung zwischen den beiden Prozessen des Gleitens und Überbrückens später untersuchen.

Das ParB-Bindungsprofil mit mehreren Peaks von C. crescentus besteht aus drei klaren Peaks, die auf fünf parS-Stellen zentriert sind (beachten Sie, dass zwei dieser parS-Stellen nur 42 bp voneinander entfernt sind und daher in unseren Abbildungen normalerweise nicht unterscheidbar sind) (Abb. 1c). . Obwohl zwei weitere mutmaßliche parS-Stellen identifiziert wurden12, sind sie nicht mit einer signifikanten Anreicherung von ParB verbunden. Dieses Profil wird in unserem Polymermodell verwendet, um die ParB-Dimerbesetzungen Bi entlang des Polymers und damit, bis zu einem Gesamtparameter kb, die Brückenbildungsrate zwischen proximalen Monomerpaaren anzugeben. Bei der Simulation des Systems fanden wir ein überraschendes Ergebnis: Die ParB-induzierte Verbrückung führt zu zwei unterschiedlichen Phasen für den Partitionskomplex. Lange Brückenlebensdauern führen dazu, dass das Polymer in eine kügelchenartige Struktur kollabiert (Abb. 1f), wohingegen bei kürzeren Brückenlebensdauern das Polymer strukturierter ist und lange, ausgedehnte lokale Brückenbereiche aufweist (Abb. 1h). Beachten Sie, dass „lang“ und „kurz“ relativ zur polymeren Zeitskala τ sind. Da uns keine experimentelle Schätzung dieser Zeitskala auf der hier betrachteten Längenskala (20 bp) vorliegt, können wir keine spezifischen Werte angeben.

Der Effekt war auch in Karten sichtbar, die den Standort der ParB-Brücken zeigten (ergänzende Abbildung 1b, d). Während Brückenkarten der strukturierten Konformationen ausgeprägte ±45∘-Linien aufweisen, weisen die Karten des kugelförmigen Bereichs eine eher zufällige Verteilung auf. Trotz der deutlichen Unterschiede in ihren Konformationen weisen beide Regime jedoch sehr ähnliche Brückenkarten auf Populationsebene auf (ergänzende Abbildung 1c, e), die ein Schachbrettmuster mit der Mitte der parS-Stellen aufweisen und keine ± 45∘-Linien erkennbar sind . Ein solches Muster steht im Einklang mit einer allgemeinen Präferenz für Kontakte innerhalb und zwischen Regionen, die mit Peaks im ParB-Bindungsprofil verbunden sind. Ein ähnliches Muster wurde auch in Kontaktwahrscheinlichkeitskarten beobachtet (Abb. 1g, i), obwohl das kugelförmige Regime mehr Kontakte bei gleicher Anzahl von Brücken aufwies, wie aufgrund seines höheren Verdichtungsgrads zu erwarten war. Dies verdeutlicht, dass die bevölkerungsdurchschnittliche Sicht auf die DNA-Organisation möglicherweise keinen Aufschluss über die Struktur einzelner Konformationen gibt.

Um diese verschiedenen Regime besser zu charakterisieren, haben wir das Phasendiagramm des Systems erstellt (Abb. 1d). Es konnten drei Bereiche identifiziert werden: ein freier, spulenartiger Bereich, in dem es sehr wenige Brücken gibt (weniger als 20, ein Wert, der durch Inspektion ausgewählt wurde) und in dem das Polymerverhalten einfach durch seine Steifheit und seinen Volumenausschluss bestimmt wird (ergänzende Abbildung 1f, g) und die strukturierten und globulären (unstrukturierten) Regime. Wir haben den Übergang zwischen dem strukturierten und dem kugelförmigen Bereich mithilfe des ParB-gewichteten Radius definiert, dh des Radius der räumlichen ParB-Verteilung aufgrund der Polymerkonformation (siehe Methoden). Der kugelförmige Zustand hat einen viel kleineren ParB-gewichteten Radius im Vergleich zum strukturierten Zustand mit der gleichen Anzahl von ParB-Brücken (Abb. 1e). Dieser Radius erreicht ein Plateau, wenn das System weiter in den kugelförmigen Bereich vordringt. Wir haben daher einen Schwellenwert von 55 nm gewählt, um die beiden Regime auf der Grundlage von zwei Standardabweichungen über dem Plateau-Mittelwert zu unterscheiden (Abb. 1e).

Wir schlagen vor, dass diese beiden Regime aufgrund des Ausmaßes der Bewegung entstehen, die das Polymer zwischen Brückenereignissen ausführt. Die Verbrückung kann entweder kinetisch begrenzt (begrenzt durch die intrinsischen Verbrückungs-/Entbrückungsraten) oder diffusionsbegrenzt sein (Näherung der Monomere ist der begrenzende Faktor und die Kinetik ist so schnell, dass das Brechen und Bilden von Brücken miteinander korreliert, da neu gebrochene Brücken dazu neigen, sich vorher zu rekombinieren). das Polymer kann den Konformationsraum erkunden)39. Betrachten Sie eine verbrückte Polymerkonformation (ergänzende Abbildung 1h). Im diffusionsbegrenzten Bereich erhöht die Rekombination effektiv die Brückenlebensdauer (die Aktivierungsenergie der Brückenbildung)40,41. Dies verstärkt einen kooperativen Effekt, bei dem es wahrscheinlicher ist, dass sich neue Brücken in der Nähe einer bestehenden Brücke bilden, da benachbarte Monomere mit größerer Wahrscheinlichkeit ebenfalls in der Nähe sind oder in die Nähe kommen und die Zeit, die für die Bildung einer neuen Brücke benötigt wird, viel kürzer ist als die (verlängerte) Brückenlebensdauer. Die Wiederholung dieses Vorgangs führt zu den erweiterten Brückenbereichen, die wir beobachten (ergänzende Abbildung 1h). Die Konformationskosten der Verbrückung werden auch durch die Ansammlung von Brücken reduziert. Ein ähnlicher Effekt wurde bereits in Simulationen des Brückenproteins H-NS42 beobachtet. Andererseits sind bei langen Brückenlebensdauern Brückenereignisse kinetisch begrenzt und das Polymer ist in der Lage, den Konformationsraum zwischen Brückenereignissen neu zu organisieren und zu erkunden. Infolgedessen gibt es abseits bestehender Brücken viel mehr potenzielle Brückenereignisse (Näherung von Monomeren) als im diffusionsbegrenzten Regime mit kurzer Lebensdauer. Dies führt sowohl zu mehr Brücken als auch zu einer zufälligeren Verteilung der Brücken (ergänzende Abbildung 1b) und damit zu einer kugelförmigen Polymerkonfiguration (ergänzende Abbildung 1h). Durch die Erhöhung der Anzahl der Brücken werden die zusätzlichen Konformationskosten überwunden, die dadurch entstehen, dass die Brücken verteilt und nicht wie im strukturierten Regime lokalisiert sind.

Da das globuläre Regime an frühere Vorschläge für die Organisation komplexer Partitionen11,20,21 erinnert, werden wir uns als nächstes auf die Untersuchung des strukturierten Zustands konzentrieren. Wir werden im letzten Abschnitt auf den Kugelzustand zurückkommen.

Das bei kurzen ParB-Brückenlebensdauern gefundene strukturierte Regime wird durch das Vorhandensein zweier unterschiedlicher Strukturen, Haarnadeln und Helices, definiert. Haarnadeln entstehen, indem sich das Polymer um 180∘ nach hinten biegt und Brücken zwischen antiparallelen Segmenten bildet, während sich das Polymer bei Helices um volle 360∘ dreht und Brücken zwischen parallelen Segmenten bildet (Abb. 2a). Diese beiden Bauwerke unterscheiden sich optisch, weisen aber auch unterschiedliche zugrunde liegende Brückenmuster auf, sodass sie in Brückenkarten eindeutig identifiziert werden können. Haarnadeln entsprechen +45∘-Linien, während Helices −45∘-Linien entsprechen. Die Lage der Linie relativ zur Hauptdiagonalen gibt die Länge der Haarnadelschleife bzw. die Periode der Helix an. Es überrascht nicht, dass sich diese Strukturen im Allgemeinen in der Nähe der parS-Stellen bilden. Wir beobachteten jedoch erhebliche Unterschiede: Die Spitze einer Haarnadelkurve (angezeigt durch die Stelle, an der die 45∘-Linie in der Brückenkarte die Hauptdiagonale schneidet) war oft einigermaßen weit vom nächstgelegenen parS-Standort entfernt (Abb. 2a). Bei niedrigeren Brückenbildungsniveaus bilden sich diese Strukturen am häufigsten innerhalb der Region, die vom zentralen Peak mit drei parS-Stellen abgedeckt wird.

a Beispielstrukturen mit entsprechenden Brückenkarten (Brückenkarten wurden erweitert, um die Linien klarer zu machen) für Haarnadelkurven und Helices mit durchschnittlich 30 Brücken. Die vollständigen Polymerkonformationen und Brückenkarten sind in der ergänzenden Abbildung 2a zu sehen. Rote Punkte zeigen die parS-Sites an. Beachten Sie, dass zwei der Standorte nicht immer unterscheidbar sind, da sie nur 42 bp voneinander entfernt sind. b Mittlere Anzahl an Haarnadeln und Helices pro Konformation. Die Schattierung stellt das SEM dar. c Durchschnittliche Kontaktkarte für das Polymer bei durchschnittlich 30 kurzlebigen Brücken. d Mittleres vom Polymer eingenommenes Volumen und mittlerer ParB-gewichteter Radius. Die Schattierung stellt die SD dar. Die gepunktete Linie bei 78 nm zeigt den experimentell bestimmten ParB-Radius für C. crescentus. e Dreidimensionale ParB-Dichte aus Partitionskomplexen mit durchschnittlich 30 Brücken mit einem Radius von 78 nm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir nutzten die markanten ±45∘-Linien, um das Auftreten von Haarnadeln und Helices als Funktion des Brückenbildungsgrads im System zu quantifizieren (Abb. 2b). Wir fanden heraus, dass die Häufigkeit beider Strukturen ungefähr linear mit der Anzahl der Brücken zunahm, wobei Haarnadeln am häufigsten vorkamen. Von ~ 30 Brücken enthielt jede Konformation mindestens eine Struktur (ergänzende Abbildung 2b). Bei den höchsten untersuchten Brückenniveaus (~100 Brücken) enthielt jede Konformation 3–4 Strukturen, die von beiden Typen sein konnten und mehrere und entfernte parS-Stellen umfassen konnten. Dennoch konnten die unterschiedlichen Bauwerke anhand der ±45∘-Linien in den Brückenkarten noch identifiziert werden. Wie im vorherigen Abschnitt erläutert, sind die ±45∘-Linien jedoch nicht in der Ensemble-Durchschnittskontaktkarte oder Brückenkarte sichtbar, die ein Schachbrettmuster mit der Mitte auf den parS-Standorten aufweist (Abb. 2c und ergänzende Abb. 2c).

In Übereinstimmung mit In-vitro-Experimenten führte die ParB-Verbrückung zur Kondensation des DNA-Polymers. Sowohl das eingenommene Volumen (Definition siehe Methoden) als auch der quadratische Gyrationsradius nahmen mit der Anzahl der Brücken ab (Abb. 2d, ergänzende Abb. 2d). In vivo wird der Nukleoproteinkomplex durch die räumliche Verteilung einer fluoreszierend markierten Variante von ParB sichtbar gemacht, die innerhalb der Zellen unterschiedliche Herde bildet. Um diese Beobachtungen zu verknüpfen, kombinierten wir die genomische Verteilung von ParB auf der DNA (basierend auf dem ChIP-seq-Profil) mit unseren simulierten Konformationen des DNA-Polymers, um die resultierende räumliche Verteilung von DNA-gebundenem ParB zu erhalten (Abb. 2e). . Die resultierende sphärische Dichte erinnerte an die experimentell beobachtete Dichte unter Verwendung der Einzelmolekülmikroskopie. Der Radius des Partitionskomplexes von C. crescentus wurde experimentell mit hochauflösender PALM-Mikroskopie auf ~78 nm35 gemessen. Dies konnte in unseren Simulationen mit nur 30 ParB-Brücken erreicht werden. Dies entspricht einem Rückgang um 20 % im Vergleich zum Wert ohne Brückenbildung (Abb. 2d).

In den vorherigen Abschnitten haben wir die Frage, wie die genomische Verteilung von ParB gebildet wird, ignoriert und uns stattdessen darauf konzentriert, wie die beobachtete Verteilung durch Überbrückung die Organisation und Verdichtung der zentromeren Region beeinflussen kann. In diesem Abschnitt machen wir das Gegenteil und betrachten, wie sich ParB entlang der DNA ausbreitet, wobei wir mögliche Auswirkungen der ParB-Überbrückung ignorieren. Mehrere aktuelle In-vitro-Studien haben gezeigt, dass ParB-Dimere chromosomaler ParABS-Systeme (C. crescentus, Myxococcus xanthus und Bacillus subtilis) DNA an parS einschließen können, bevor sie in eine Richtung weggleiten, ähnlich einer DNA-Klemme13,24,25,26 ,27,28,30. Es wird angenommen, dass die Dissoziation hauptsächlich auf die CTP-Hydrolyse zurückzuführen ist. Wir haben kürzlich ein stochastisches Modell dieses Ausbreitungsmechanismus im Zusammenhang mit M. xanthus13 entwickelt und festgestellt, dass die Beladung an parS-Stellen, die 1D-Diffusion entlang der DNA und die Dissoziation tatsächlich in der Lage waren, das beobachtete ParB-Bindungsprofil von ChIP-Seq qualitativ zu reproduzieren. Der vorhergesagte 1D-Diffusionskoeffizient stimmte auch mit Einzelmolekül-Mikroskopiemessungen überein. Allerdings ist das Bindungsprofil von M. xanthus relativ verrauscht und besteht größtenteils aus einem einzelnen Peak, der sich auf eine Ansammlung aller seiner 24 parS-Stellen bis auf eine konzentriert. Daher kann das mehrstufige und weniger verrauschte Profil von C. crescentus als besserer Test für die In-vivo-Relevanz des Belastungs- und Gleitmodells dienen. Während andere ParB-Bindungsprofile mit mehreren Spitzen verfügbar sind21,32,33,34, wurde die Bindungsaffinität jeder parS-Stelle von C. crescentus bestimmt, sodass die ParB-Beladung im Modell mithilfe eines einzigen Parameters und nicht jeweils eines Parameters beschrieben werden kann parS-Site.

Wir verwenden dasselbe grundlegende Modell wie zuvor13, modifiziert für C. crescentus. ParB-Dimere werden an jeder der fünf parS-Stellen auf die als 1D-Gitter modellierte DNA geladen. Beladene Dimere diffundieren dann mit dem effektiven Diffusionskoeffizienten D entlang des Gitters und dissoziieren zufällig mit einer Geschwindigkeit koff (Abb. 3a). Frühere experimentelle Studien haben gezeigt, dass ParB-Dimere beim Laden an parS-Stellen eine Proteinklammer bilden, die den DNA-Strang vollständig umschließt und anschließend entlang desselben gleitet13,24,25,26,27,28. In Übereinstimmung damit wurde gezeigt, dass ParB-Dimere nicht in der Lage sind, DNA-gebundene Straßensperren zu überwinden25,27. Beachten Sie, dass wir in unserem Modell aufgrund des relativ engen Einschlusses des DNA-Strangs davon ausgehen, dass gleitende ParB-Dimere als Hindernisse füreinander wirken (basierend auf den Strukturen ist nicht zu erwarten, dass ein Dimer die Schleife eines anderen passieren kann13,25, 26). Die parS-Stellen müssen außerdem frei sein, damit ein Dimer geladen werden kann. Die Gesamtzahl der ParB-Dimere ist auf den gemessenen Wert von 36035 festgelegt, wobei ungebundene Dimere als gut gemischte Massenpopulation (zytosolische Population) behandelt werden. Die relative Beladungsrate an jeder Stelle wird durch ihre relative Affinität zu ParB12 angegeben, sodass eine einzige Gesamtbeladungsrate kon übrig bleibt.

ein Diagramm, das das Gleitmodell darstellt und zeigt, wie ParB-Dimere an einer parS-Stelle binden, entlang des Gitters diffundieren und sich lösen. b Repräsentative Bilder der Fluoreszenzwiederherstellung nach dem Photobleaching-Experiment (FRAP). Ein einzelner eGFP-ParB-Fokus (Pfeil) wurde in einer Zelle mit zwei Brennpunkten photogebleicht. Der Maßstabsbalken beträgt 1 μm. Alle Zeitrafferbilder für diese Zelle sind in der ergänzenden Abbildung 3a zu sehen. c Analyse von FRAP-Daten. Die durchschnittliche relative Intensität des gebleichten (blau) und des ungebleichten (grün) Partitionskomplexes wird als Funktion der Zeit dargestellt (n = 51 Zellen). Gestrichelte Linien stellen das Verhalten eines angepassten Modells dar, das eine Halbwertszeit von 64 s ergab (siehe Methoden). Die Schattierung stellt die SD dar. d Simulation des ParB-Gleitens im Vergleich zu ChIP-seq-Daten aus Lit. 12, beide normalisiert durch maximale Höhe. Der schattierte Bereich zeigt den Teil des ChIP-seq-Profils an, der an eine Exponentialfunktion angepasst wurde, um den effektiven Diffusionskoeffizienten zu ermitteln. e Simulationen des ParB-Gleitens bei einer Verweilzeit von 1 s für verschiedene Straßensperrenbelegungen. Die Straßensperre ist durch den gelben Punkt gekennzeichnet. Ähnliche Feigen. Die Verweilzeiten für 10 und 100 Sekunden sind in der ergänzenden Abbildung 3d dargestellt. f Wie in e, jedoch mit einer Auslastung von 75 % und unterschiedlicher Lebensdauer der Straßensperre. In e und f zeigt die gepunktete Linie das Profil, wenn keine Straßensperre vorhanden ist. g Phasendiagramm, das den Unterschied zwischen Simulationen mit und ohne Straßensperre zeigt. Die Farbe gibt das Verhältnis der Fläche der Verteilung rechts von der Straßensperre zur Gesamtfläche auf der rechten Seite des parS-Geländes an. Die Standorte der Straßensperre und der ParS-Site werden in e oder f angezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir bestimmen zunächst den effektiven Diffusionskoeffizienten D und die Dissoziationsrate koff. Um Letzteres abzuschätzen, führten wir eine Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung (FRAP) von eGFP-ParB-Herden in Zellen vor der Teilung durch, die zwei Herde (Partitionskomplexe) enthielten (Abb. 3b). Nach dem Bleichen eines der beiden Herde erholte sich das Fluoreszenzsignal mit einer Halbwertszeit von 64 s (Abb. 3c, ergänzende Abb. 3a, b). Dies liefert eine Schätzung für die Dissoziationsrate koff (siehe Methoden). Interessanterweise wurden für M. xanthus13 und F-Plasmid21,43 ungefähr ähnliche ParB-Erholungszeiten gemessen.

Um den Diffusionskoeffizienten zu bestimmen, passen wir den äußeren Teil des dritten Peaks an ein exponentielles ex/λ mit \(\lambda=\sqrt{\frac{D}{{k}_{{{{{{{{\rm {off}}}}}}}}}}}\) (Abb. 3d), die vorhergesagte Kontinuumsverteilung unter diesem Modell für eine isolierte parS-Site (siehe Methoden). Der angepasste Wert von λ = 710 bp ergibt dann D = 5600 bp2 s−1 = 6,1 × 10−4 μm2 s−1. Dies ist niedriger als zuvor berichtete Diffusionskoeffizienten für Proteine, die entlang bakterieller DNA diffundieren,44 einschließlich früherer Messungen von ParB13,43, die in der Größenordnung von 10−2 μm2 s−1 liegen. Wir werden weiter unten sehen, dass im gekoppelten Modell ein größerer Wert erforderlich ist, um den Blockadeeffekt von Brücken zu überwinden.

Ein Modellparameter muss noch bestimmt werden – die Gesamtbelastungsrate von ParB kon. Frühere Messungen haben geschätzt, dass sich etwa 80 % (290) der ParB-Dimere in der Zelle in ParB-Foci35 befinden. Im Gegensatz dazu stellen wir fest, dass selbst bei hohen Beladungsraten <220 ParB-Dimere mit der DNA assoziiert sind (ergänzende Abbildung 3c). Eine weitere Erhöhung von kon erhöht die Anzahl der gebundenen ParB nicht wesentlich, da die parS-Stellen fast kontinuierlich besetzt sind. Die Ungleichheit in der Anzahl der DNA-assoziierten Dimere kann auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein. Erstens hängt die maximal mögliche Anzahl assoziierter Dimere in unseren Simulationen von der gewählten Diskretisierung ab, da jeder Gitterplatz/Monomer durch ein einzelnes ParB-Dimer gebunden werden kann. Wenn also der Footprint von ParB kleiner als unsere Diskretisierungsgröße von 20 bp ist, würden wir die erreichbare ParB-Belegung unterschätzen. Zweitens basiert die In-vivo-Schätzung der zellulären ParB-Konzentration auf quantitativem Western Blot, das eine erhebliche Fehlerquote aufweist45. ParB-Foci können auch eine zytosolische oder unspezifisch gebundene Population enthalten, die in unserem Modell nicht berücksichtigt wird.

Vor diesem Hintergrund wählen wir die Laderate für unser Modell, indem wir die beste Anpassung der Simulationen an die ChIP-seq-Daten finden (ergänzende Abbildung 3c) und erhalten kon = 200 ⋅ koff. Dies führt zu einer bemerkenswert guten Übereinstimmung zwischen dem Modell und dem ChIP-Seq-Profil (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass die Beladung und das diffusive Gleiten von ParB-Dimeren tatsächlich das beobachtete Bindungsprofil erklären können. Dies deutet auch darauf hin, dass Dimere von der Transkription und anderen Prozessen, die die ParB-Ausbreitung behindern könnten, weitgehend unberührt bleiben, da wir diese Effekte in unserem Modell nicht berücksichtigt haben. Dies ist möglicherweise nicht der Fall für andere Systeme wie das F-Plasmid, die Änderungen im Bindungsprofil zeigen, die mit Promotoren übereinstimmen21,46. Tatsächlich haben In-vitro-Experimente gezeigt, dass hochaffine DNA-bindende Proteine ​​wie EcoRI (mit der katalytisch inaktiven E11Q-Mutation) und TetR das Gleiten von ParB-Dimeren entlang der DNA blockieren können25,27,30.

Um besser zu verstehen, wie sich Straßensperren auf die Ausbreitung von ParB-Dimeren auswirken können, haben wir mithilfe unserer Gleitsimulation die Auswirkungen auf die Ausbreitung von einer einzelnen parS-Stelle aus untersucht. Stellvertretend für die biologische Situation betrachten wir kein permanentes Hindernis, sondern ein dynamisches Hindernis, das wir anhand seiner durchschnittlichen Lebensdauer und Belegung spezifizieren, also des gesamten Zeitanteils, in dem das Hindernis an die DNA gebunden ist. Diese beiden Maße sind unabhängig voneinander. Beispielsweise hat eine Straßensperre, die jeweils 1 Sekunde lang vorhanden und nicht vorhanden ist, die gleiche Auslastung von 50 % wie eine Straßensperre, die jeweils 10 Sekunden lang vorhanden und nicht vorhanden ist. Wir fanden heraus, dass die Straßensperre bei einer Lebensdauer von 1 s einen überraschend milden Effekt auf die Ausbreitung hatte und sich erst ab einer Belegung von ~75 % bemerkbar machte. Selbst bei einer Belegung von 95 % gleitet etwa die Hälfte der Dimere an der Stelle der Straßensperre vorbei wie ohne diese (Abb. 3e). Ebenso wurde bei einer Auslastung von 75 % ein negativer Effekt auf die Ausbreitung nur bei Straßensperrenlebensdauern < ~ 1 s beobachtet (Abb. 3f).

Wir können diese Ergebnisse wie folgt verstehen. Wenn die Straßensperre für einen viel kürzeren Zeitraum vorhanden ist als das Zeitintervall zwischen Dimer-Kreuzungsversuchen, entsteht kein Rückstau an Dimeren. Selbst für längere Zeiträume kann der Rückstand an Dimeren beseitigt werden, wenn zwischen den Straßenblockierungsereignissen genügend Zeit liegt, dh wenn die durchschnittliche Straßenblockierungsbelegung ausreichend niedrig ist (Abb. 3g). Diese Ergebnisse könnten erklären, warum wir keine signifikante Abweichung des ParB-Bindungsprofils von dem beobachten, was von unserem einfachen Belastungs- und Gleitmodell erwartet wird – die In-vivo-Belegung und Verweilzeiten von Proteinen, die an die zentromere Region von C. crescentus binden, sind möglicherweise einfach nicht groß genug erheblichen Einfluss auf die ParB-Ausbreitung haben.

Als nächstes untersuchen wir, ob die ParB-Überbrückung mit dem ParB-Bindungsprofil kompatibel ist, dh würde die spontane Bildung von ParB-Brücken zwischen räumlich proximalen, aber genomisch entfernten ParB-Dimeren die gesamte ParB-Ausbreitung begrenzen und ein grundlegend anderes Bindungsprofil erzeugen? Um diese Frage zu beantworten, haben wir unsere Polymer- und Gleitsimulationen miteinander gekoppelt (Abb. 4a). Im Gegensatz zu den vorherigen Simulationen hängt die Verbrückung proximaler Monomere nun explizit von der Anwesenheit eines ParB-Dimers an jeder Stelle ab und nicht von einer vorab festgelegten ParB-Verteilung. Beachten Sie, dass das ParB-Gleiten ein Nichtgleichgewichtsprozess ist und dieses gekoppelte Modell daher notwendigerweise nicht im Gleichgewicht ist. Wir gehen davon aus, dass verbrückte Dimere aufgrund des Einschlusses genomisch entfernter Regionen nicht in der Lage sind, entlang der DNA zu gleiten, sodass sie als Hindernisse für nicht verbrückte gleitende Dimere fungieren. Die Simulationen werden bis zum stationären Zustand durchgeführt und die ParB-Verteilungen und Polymerkonformationen aufgezeichnet.

a Darstellung gekoppelter Polymersimulationen, in denen wir Brückenbildung und Gleiten kombinieren. b Profil von ParB, generiert aus Gleit- und Überbrückungssimulationen mit einer Brückenlebensdauer von 1 Sekunde im Vergleich zu ChIP-seq-Daten aus einer früheren Studie12, beide normalisiert durch maximale Höhe. c Beispiele für Haarnadel- und Helixstrukturen, die in gekoppelten Simulationen gefunden wurden, mit durchschnittlich 25 Brücken. Vollständige Konformationen und einzelne Brückenkarten finden Sie in der ergänzenden Abbildung 4a. d Durchschnittliche Kontaktkarte für gekoppelte Simulationen (oben rechts) und ungekoppelte Simulationen (unten links) mit einem Radius von ~78 nm. Jede Kontaktkarte wird aus 1000 Simulationen erstellt. e Dreidimensionaler Durchschnitt des ParB-Verteilungskomplexes für 25 Brücken mit einem Radius von 78 nm. f Diagramm, das die Hinzufügung von ParB-ParB bei der cis-Rekrutierung zum gekoppelten Modell zeigt. g Profil von ParB entlang des Polymers mit zusätzlicher ParB-ParB-Rekrutierung. Bereiche, in denen sich das Profil erheblich von den ChIP-seq-Daten unterscheidet, sind rot hervorgehoben. Für alle gezeigten Diagramme liegen die Simulationen im strukturierten Regime vor. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die gleichen im vorherigen Abschnitt ermittelten Werte werden für die ParB-Dimerbeladung (kon = 200 ⋅ koff) und die Dissoziation (\({k}_{off}=\frac{\log (2)}{64}{{{{ {{{{\rm{s}}}}}}}}}^{-1}\)). Zur Lebensdauer der Brücke liegen derzeit keine Schätzungen vor. Wir gehen davon aus, dass Brücken eine deutlich kürzere Lebensdauer haben als ParB-Dimere auf der DNA und daher wird ein Nominalwert von kub = 1 s−1 gewählt. Bei einem zu hohen Wert (in der Größenordnung der ParB-Lebensdauer auf der DNA) hätten gleitende ParB-Dimere keine Zeit, Hindernisse (ParB-Brücken) zu überwinden, bevor sie sich lösen. Wir erreichen die beiden im ersten Abschnitt besprochenen Regime über die Mobilität des Polymers. Wir wählen willkürlich zwei Werte von p aus, um die kugelförmigen und strukturierten Regime darzustellen (basierend auf dem Sweep des einfachen Brückenmodells). Damit bleiben der gleitende Diffusionskoeffizient und die Gesamtverbrückungsrate als freie Parameter übrig. Diese werden so ausgewählt, dass wir sowohl einen ParB-Radius von 78 nm als auch die erwartete Genomverteilung reproduzieren können. Wir können den im vorherigen Abschnitt gefundenen Wert für den Diffusionskoeffizienten nicht verwenden, da die Einführung von ParB-Brücken dazu führt, dass ParB-Dimere eine kürzere Distanz zurücklegen und schärfere Peaks erzeugen. Daher muss dieser Wert basierend auf der Anzahl der ParB-ParB-Brücken abgestimmt werden. Für das unten diskutierte strukturierte Regime wird ein Wert von 4,4 × 10−3 μm2 s−1 verwendet, um das ChIP-seq-Profil für 25 Brücken aufzulösen. Dies ist eine Untergrenze. Größere Werte haben nur sehr geringe Auswirkungen auf das wiederhergestellte ParB-Profil, da gleitende ParB-Dimere zwischen Brückenereignissen ein Gleichgewicht erreichen. Diese untere Grenze liegt innerhalb einer Größenordnung des in vivo gemessenen Diffusionskoeffizienten von ParB13,43.

Für das strukturierte Regime stellten wir fest, dass die gekoppelten Simulationen das mit ChIP-seq gemessene Bindungsprofil (Abb. 4b) mit einer noch besseren Anpassung reproduzieren konnten, als wir es mit der nicht-polymeren Gleitsimulation erhalten hatten (Abb. 3d). Wichtig ist, dass wir auch die gleichen Haarnadel- und Helixstrukturen wie in den ungekoppelten Polymersimulationen beobachteten, bei denen das ParB-Bindungsprofil als Eingabe angegeben wurde (Abb. 4c) und sehr ähnliche durchschnittliche Kontakt- (Abb. 4d) und Brückenkarten erhielten (ergänzende Abb. 4b). Diese Strukturen verdichten das Polymer erneut und wir konnten den gemessenen Radius von 78 nm erreichen (Abb. 4e).

Im kugelförmigen Bereich konnten wir das ChIP-seq-Profil weitgehend reproduzieren, obwohl die Simulationen die Tiefe der Täler nicht genau erfassen konnten (ergänzende Abbildung 4c). Ähnliche Kontakt- und Brückenkarten wurden gefunden (Ergänzende Abbildung 4d, e). Interessanterweise ist der Partitionskomplex in den gekoppelten Simulationen bei gleicher mittlerer Anzahl von Brücken weniger verdichtet als in den ungekoppelten Simulationen, wohingegen für das strukturierte Regime kein signifikanter Unterschied festgestellt wurde (ergänzende Abbildung 4f, g).

Jüngste In-vitro-Studien haben gezeigt, dass DNA-beladene ParB-Dimere von B. subtilis unabhängig von parS zusätzliche Dimere beladen können („ParB-ParB-Rekrutierung“)47, was möglicherweise die zuvor beobachtete kooperative unspezifische DNA-Bindung erklärt15,18,19 und konsistent mit Wechselwirkungen zwischen Dimeren über ihre N-terminalen Domänen16,48. Um zu untersuchen, ob eine solche Rekrutierung in vivo relevant sein könnte, haben wir die cis-ParB-ParB-Rekrutierung zu unserem Modell hinzugefügt (Abb. 4f). Obwohl die gleichen Autoren auch gezeigt haben, dass die Rekrutierung von Transsexuellen wesentlich anspruchsvoller und rechenintensiver in der Umsetzung wäre.

Wir fanden heraus, dass selbst eine relativ niedrige ParB-ParB-Rekrutierungsrate, bei der die Gesamtzahl der gebundenen Dimere um weniger als 20 % zunahm, zu einem grundlegend anderen Bindungsprofil führt. Die ParB-Ausbreitung wurde durch das Auftreten langsam abfallender „Schultern“ an den Extremen der Verteilung verstärkt. Infolgedessen wird der im experimentellen ChIP-seq-Profil beobachtete charakteristische exponentielle Abfall nicht mehr reproduziert (Abb. 4g) und dies konnte nicht durch Änderung der Modellparameter behoben werden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die ParB-ParB-Rekrutierung in vivo keine signifikante Rolle bei der ParB-Ausbreitung spielt, was mit der Feststellung von Tišma et al. übereinstimmt. dass die ParB-ParB-Rekrutierung nur 10 % der ParB-Beladungsereignisse in vitro ausmacht47.

Das hier vorgestellte Gleit- und Brückenmodell nutzt aktuelle Entdeckungen, um die Entstehung und Struktur des Trennwandkomplexes zu untersuchen. Jüngste In-vitro-Studien haben gezeigt, dass ParB abhängig von CTP an parS-Stellen auf DNA geladen werden kann, bevor es zufällig entlang des Strangs gleitet13,24,25,26,27,28. Es wurde auch gezeigt, dass ParB DNA wiederum in Gegenwart von CTP durch die Bildung von Brücken zwischen genomisch entfernten DNA-Regionen effizient kondensieren kann10,15,29,30. Obwohl wir die CTP-abhängige Natur dieser Prozesse nicht explizit modelliert haben, stimmt unser Modell mit der CTP-Hydrolyse überein, die die Bindung von ParB-Dimeren auslöst und somit die Längenskala des Gleitens festlegt13,25. Unser Modell sagt voraus, dass das dynamische Gleiten und Überbrücken von ParB zu zwei unterschiedlichen Konformationsregimen führt, einem kugelförmigen und einem strukturierten für lange bzw. kurze Brückenlebensdauern. Letzteres Regime hängt von der Steifheit der DNA ab. Wenn dies ignoriert wird, dominieren kurzreichweitige Brücken zwischen benachbarten Monomeren und es entstehen keine DNA-Strukturen. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen früherer Studien zur Chromatinorganisation49,50, die keine Steifheit und keine Brückenbildung durch viel größere Moleküle berücksichtigen42. Wir haben auch gezeigt, wie die genomische Verteilung von ParB seine räumliche Verteilung durch die Bildung von ParB-Brücken definieren kann. Anschließend haben wir sowohl das Gleiten von ParB entlang der DNA als auch die Bildung von ParB-ParB-DNA-Brücken explizit modelliert. Wichtig ist, dass wir herausfanden, dass ausreichend kurzlebige Brücken das Gleiten von ParB entlang der DNA nicht behindern und unser Modell sowohl die gemessene genomische als auch die räumliche Verteilung von C. crescentus ParB reproduzieren konnte.

Wir spekulieren, dass die beiden unterschiedlichen Regime in unterschiedlichen biologischen Kontexten relevant sein könnten. Die Haarnadeln und Helices des strukturierten Regimes können das Laden von SMC-Komplexen (Structural Maintenance of Chromosomes) auf die DNA51 erleichtern. Obwohl bekannt ist, dass dies auf ParB an den parS-Stellen zurückzuführen ist52, ist der genaue Mechanismus Gegenstand laufender Untersuchungen53,54. Es ist jedoch auch bekannt, dass ParB-Mutationen, die die SMC-Rekrutierung verhindern, die Fähigkeit von ParB verringern, einen Nukleoproteinkomplex höherer Ordnung zu bilden53,55,56. Dies führt uns zu der Annahme, dass die von uns beobachteten ParB-induzierten DNA-Strukturen für die Beladung von SMC-Komplexen relevant sind (Abb. 5). Darüber hinaus verfügen chromosomale ParABS-Systeme häufig über mehrere getrennte parS-Stellen6, die ein Bindungsprofil mit mehreren Spitzen erzeugen9,10,12,13,21,31,32,33,34, wohingegen ein einzelner Cluster von parS-Stellen bei Plasmiden häufiger vorkommt -basierte Systeme57. Getrennte parS-Stellen würden die Bildung mehrerer Haarnadeln ermöglichen und könnten dadurch für die SMC-Beladung von Vorteil sein.

Karikatur der Struktur des Trennwandkomplexes. ParB-Dimere werden an den parS-Stellen geladen und gleiten dann entlang der DNA, wo sie mit genomisch entfernten, räumlich proximalen Dimeren interagieren können, um ParB-ParB-Brücken zu bilden. Diese Brücken können die DNA in Haarnadel- und Helixstrukturen organisieren. Haarnadelstrukturen könnten möglicherweise an der Rekrutierung von SMC auf der DNA beteiligt sein.

Im Gegensatz dazu würden ParABS-tragende Plasmide, insbesondere solche von E. coli und anderen Bakterien, die kein SMC58 tragen, diese Strukturen wahrscheinlich nicht benötigen. Stattdessen kann es von Vorteil sein, einen kompakteren Partitionskomplex zu bilden, um die Partitionierungsfunktion von ParABS besser zu erleichtern. Während sich das F-Plasmid ParB über eine viermal größere Region ausbreitet als ParB von C. crescentus11, ist der resultierende Partitionskomplex deutlich kleiner (ein Radius (2σ) von 35 nm)43. Daher spekulieren wir, dass plasmidbasierte ParABS-Systeme in der kompakteren globulären Region funktionieren könnten.

Das Bakterienchromosom ist im Durchschnitt negativ supergeknäuelt59. Dies führt zur Bildung superspiralisierter Schleifen (Plektoneme), die das Chromosom in topologisch isolierte Domänen von ca. 10 kb aufteilen60. Allerdings wurden in In-vitro-DNA-Experimenten und Simulationen auch einfache Plektoneme im niedrigen Kilobasenbereich entdeckt61,62,63. Daher können diese Strukturen, die topologisch den Haarnadeln ähneln, auf der 1–2-kb-Skala der Peaks der ParB-Verteilung relevant sein. Wir gehen davon aus, dass sie nur die Brückenbildung fördern würden, weil sie DNA-Stränge in Kontakt bringen (Helices sind wahrscheinlich weniger relevant, da sie im Vergleich zu Plektonemen thermodynamisch benachteiligt sind64). Tatsächlich wurde in einem früheren Modell der Bildung von F-Plasmid-Partitionskomplexen argumentiert, dass Supercoiling erforderlich ist, um die beobachtete Kompaktheit des Partitionskomplexes dieses Systems zu erklären .

Die Konformationen, die wir in unseren Simulationen beobachten, ähneln denen, die kürzlich mithilfe der Rasterkraftmikroskopie für B. subtilis ParB30 beobachtet wurden, es sind jedoch detailliertere Untersuchungen erforderlich, um unsere Vorhersage von Haarnadelstrukturen zu testen. Unser Modell könnte auch durch die Kenntnis der Lebensdauer der ParB-ParB-Brücke besser charakterisiert werden, was in vitro durch die Verwendung magnetischer Pinzetten erreicht werden könnte, um die Relaxationszeit von ParB-kondensierter DNA nach Entfernung von ParB aus dem Puffer zu untersuchen. Die In-vivo-Charakterisierung des Partitionskomplexes ist anspruchsvoller. Während unsere simulierten Kontaktkarten im Prinzip mit den experimentellen Kontaktkarten vergleichbar sind, die durch Chromatin Conformation Capture (HiC) erstellt wurden, reicht die Auflösung dieser Technik noch nicht aus, um die DNA-Struktur auf der kurzen Längenskala der zentromeren Region von C. crescentus zu untersuchen. Dies kann sich ändern, wenn die Technik verbessert wird65,66.

Insgesamt haben wir ein physikalisches Modell für die Bildung des Partitionskomplexes des ParABS-Systems vorgestellt. Unser dynamisches Gleit- und Brückenmodell bringt das jüngste Ergebnis, dass sich ParB entlang der DNA ausbreitet, indem es wie eine DNA-Klemme gleitet, mit der Fähigkeit von ParB in Einklang, die zentromere Region zu einem Nukleoproteinkomplex zu kondensieren. Zukünftige experimentelle Arbeiten werden bei der Bewertung des Modells und der Prüfung seiner Vorhersagen helfen.

Wir simulieren die DNA der zentromeren Region mithilfe des Bindungsfluktuationsmodells (BFM)37, einem Gitterpolymermodell, das die Rouse-Polymerdynamik reproduziert. Konkret wird die DNA als lineare Kette auf einem kubischen 3D-Gitter mit reflektierenden Randbedingungen modelliert. Jedes Monomer besetzt einen kubischen Platz des Gitters einschließlich der acht zugehörigen Gitterpunkte. Darüber hinaus kann jeder Gitterpunkt jeweils nur von einem Monomer besetzt sein, um das ausgeschlossene Volumen der Kette zu berücksichtigen. Einzelne Monomere sind durch Bindungsvektoren verbunden, die einem Satz von 108 zulässigen Vektoren entnommen werden. Dieser Satz ist so gewählt, dass die Polymerkette nicht durch sich selbst hindurchgehen kann37. Monomere können sich jeweils um einen Gitterplatz in jede kartesische Richtung bewegen, vorbehaltlich der Einschränkung zulässiger Bindungsvektoren und des ausgeschlossenen Volumens. Das Modell ist insofern ergodisch, als der Konfigurationsraum des Polymers nur mit lokalen Bewegungen abgetastet werden kann. Wir verwenden eine kinetische Implementierung, basierend auf der Gillespie-Methode67, da wir dadurch die Dynamik der Überbrückung einbeziehen können (siehe unten).

Wir gehen davon aus, dass jedes Monomer 20 bp darstellt, da dies der ungefähre Fußabdruck eines ParB-Dimers ist und zu rechnerisch nachvollziehbaren Simulationen führt. In C. crescentus breitet sich ParB über eine ~10-kb-Region des Chromosoms aus und wir simulieren daher ein Polymer mit einer entsprechenden Länge von 500 Monomeren.

Um die Steifheit der DNA zu erklären, folgen wir dem Ansatz von Zhang et al.68 und führen ein Quadrat-Cosinus-Biegepotential E zwischen aufeinanderfolgenden Bindungen ein

Dabei ist θ die Winkeländerung zwischen aufeinanderfolgenden Bindungen und ks ein Parameter, der die Steifigkeit steuert. Beachten Sie, dass eine Monomerbewegung drei Bindungswinkel beeinflusst: den Winkel am Monomer und an seinen beiden Nachbarn. Versuchte Bewegungen werden dann mit der Wahrscheinlichkeit \(P={{{{{\rm{min}}}}}}(1,\exp (-{{\Delta }}E/{k}_{B}T) akzeptiert. )\), wobei ΔE/kBT die Energieänderung aufgrund der Bewegung ist. Zulässige Monomerbewegungen (Bewegungen, die den Bedingungen des Volumenausschlusses, der Bindungslänge und der Brückenlänge gehorchen) werden mit einer Geschwindigkeit p versucht. Wir setzen den Steifigkeitsparameter k = 14, um eine Persistenzlänge (berechnet anhand des Winkels zwischen aufeinanderfolgenden Bindungen 68 ) von 120 bp (ergänzende Abbildung 1a) im Einklang mit experimentellen Messungen 38 zu erhalten.

Ähnlich wie bei anderen Bakterien macht die chromosomale DNA in C. crescentus einen Volumenanteil von ~1–2 % aus. Dieses Volumenverhältnis erhalten wir in den Simulationen durch entsprechende Einstellung der Gittergröße. Im BFM ist das vom Polymer eingenommene Volumen aufgrund der großen Menge an Bindungsvektoren keine feste Größe – das mit jedem Monomer verbundene ausgeschlossene Volumen kann sich überlappen. Wir können jedoch das besetzte Volumen messen, indem wir das dreidimensionale Binärbild, das die Besetzung jedes Gitterplatzes beschreibt, mithilfe eines kubischen Strukturierungselements der Breite 3 erweitern (wir verwenden die MATLAB-Funktion strel). Dies ergibt genau das ausgeschlossene Volumen des gesamten Polymers (denken Sie daran, dass jedes Monomer acht Gitterpunkte eindeutig besetzt). Unter Verwendung eines kubischen 90 × 90 × 90-Gitters und des oben gewählten Steifigkeitsparameters finden wir einen ausgeschlossenen Volumenanteil von 1,7 % (ein ausgeschlossenes Volumen pro Monomer von ~22 Gitterplätzen).

Auf diesem steifen Polymergerüst implementieren wir Brücken zwischen nicht benachbarten Monomeren. Unsere Implementierung ähnelt der von Bohn und Heermann69. Alle zwei nicht benachbarten Monomere, die sich innerhalb eines räumlichen Abstands von drei Gitterplätzen (genauer gesagt weniger als) befinden, dürfen eine Brücke bilden. Die Geschwindigkeit (Wahrscheinlichkeit) der Brückenbildung hängt von den Positionen der Monomere innerhalb des Polymers ab. In Abb. 1 und 2 wird die Rate bis zu einem Gesamtfaktor durch das ParB-Bindungsprofil angegeben (bestimmt durch Binning des experimentellen ChIP-Seq-Profils bei der 20-bp-Auflösung des Polymers). Die Rate der Brückenbildung zwischen zwei Monomeren, die sich in der Nähe befinden, ist dann gleich der gesamten Brückenbildungsrate, kb, multipliziert mit dem Produkt der ParB-Besetzung an jeder Stelle, BiBj. Verbrückte Monomere können sich weiterhin auf dem Gitter bewegen, müssen jedoch eine Brückenlänge von unbedingt weniger als 3 einhalten. Jedes Monomer kann nur mit höchstens einem anderen Monomer eine Brücke bilden.

Brücken brechen zufällig mit einer mittleren Lebensdauer von 1/kub und in diesem Manuskript wird ein Wert von 1 s verwendet. Die Zeitskala der Monomerdynamik τ = 1/p ist auf den hier simulierten kurzen Längenskalen experimentell nicht bekannt. Im ersten Teil dieser Arbeit ist nur das Verhältnis dieser beiden Zeitskalen relevant, sodass wir kub unverändert lassen und die Bewegungsgeschwindigkeit p des Polymers variieren können. Für das in Abb. 1d dargestellte Phasendiagramm variieren wir p von 20 bis 2 × 106, für den Rest der Arbeit nehmen wir die willkürlich gewählten Werte von p = 40 zur Darstellung des strukturierten Regimes und p = 4 × 103 für das globuläre Regime , dargestellt durch die weißen gepunkteten Linien in Abb. 1d.

Für jeden gegebenen Parametersatz werden zunächst Simulationen durchgeführt, bis das Gleichgewicht erreicht ist, das dadurch bestimmt wird, dass das vom Polymer eingenommene Volumen einen annähernd konstanten Wert erreicht. Wir verwenden das eingenommene Volumen anstelle des üblichen quadratischen Gyrationsradius, da sich ersteres als viel weniger verrauschtes Maß erwies. Anschließend wird die Konformation des Polymers aufgezeichnet. Wir wiederholen diesen Vorgang für 1000 zufällige Anfangskonfigurationen.

Der ParB-Radius wird berechnet, indem die genomische Verteilung von ParB auf der DNA (entweder basierend auf dem ChIP-seq-Profil für die ungekoppelten Polymersimulationen oder der simulierten Position von ParB-Dimeren in den gekoppelten Simulationen) mit den simulierten Konformationen des DNA-Polymers kombiniert wird Erhalten Sie eine räumliche Verteilung von DNA-gebundenem ParB. Wir nehmen einen Durchschnitt über alle 1000 Konformationen und richten sie anhand ihrer Schwerpunkte aus, um eine 3D-Dichte zu erhalten. Anschließend bestimmen wir den Radius, in dem sich 95 % der ParB-Dimere befinden. Wir rechnen diesen Wert wie folgt von Gittereinheiten in Nanometer um. In unseren (steifen) Polymersimulationen variiert die Bindungslänge zwischen Monomeren, liegt aber im Durchschnitt bei 3,0 Gittereinheiten. Da jede Bindung/Monomer 20 bp entspricht und die Länge eines Basenpaares 0,33 nm70 beträgt, entspricht eine Gittereinheit 2,2 nm.

Wir modellieren das Laden, Gleiten (Diffusion) auf und Lösen von ParB-Dimeren von der DNA mit dem gleichen Ansatz wie in unserer jüngsten Arbeit an M. xanthus13. Die DNA wird als eindimensionales Gitter modelliert, wobei jede Gitterstelle 20 bp entspricht. Bei dem Modell handelt es sich um ein Einzelbelegungsmodell – Belastung und Gleiten können nur erfolgen, wenn die Zielgitterstelle frei ist. ParB-Dimere können an einer bestimmten Anzahl spezieller Gitterplätze geladen werden, die den parS-Stellen entsprechen. Für die Gleitsimulationen in C. crescentus wird die relative Belastungsrate an jeder parS-Stelle durch \(\frac{1}{{K}_{d}}\) bestimmt, wobei Kd die gemessene Dissoziationskonstante12 ist. Die Belastungsrate an jedem Standort wird dann durch Multiplikation mit einem Gesamtfaktor kon ermittelt. Dimere diffundieren mit einer Rate d = D/h2 zu unbesetzten benachbarten Gitterplätzen, wobei D der effektive Diffusionskoeffizient und h der Gitterabstand ist. Die Entbindung erfolgt zufällig mit Rate koff. Die Gesamtzahl der Dimere wird für C. crescentus auf 360 geschätzt35. Es wird davon ausgegangen, dass sich alle ungebundenen Dimere im Zytoplasma befinden, das unserer Meinung nach gut gemischt ist. Dies ist eine vereinfachende Annahme und wir erheben keine Aussagen zum Mechanismus des ParB-Targetings auf die parS-Sites. Offensichtlich muss es im Verhältnis zum gemessenen 64-s-Umsatz des Partitionskomplexes schnell genug sein. Dies könnte durch die hohe lokale Konzentration gebundener Dimere in der Nähe der parS-Stellen erleichtert werden (in diesem Fall wäre das Zytosol tatsächlich nicht gut gemischt). Aus Sicht des Modells würde dies lediglich bedeuten, dass eine geringere Laderate kon ausreichen würde, um die gleiche Menge an ParB zu laden.

Für jeden Parametersatz wird die Simulation zunächst ausgeführt, bis der stationäre Zustand erreicht ist, und dann wird die Verteilung von ParB in regelmäßigen Zeitintervallen aufgezeichnet, die ausreichend voneinander getrennt sind, um unabhängige Stichproben der stationären Verteilung zu sein.

Wir bieten eine analytische Beschreibung des Gleitens für den vereinfachten Fall einer einzelnen parS-Site. Betrachten Sie ParB-Dimere, die auf einem unendlichen Einzelbesetzungsgitter (Gitterabstand h) diffundieren. Dimere können sich mit einer Geschwindigkeit d zu jedem unbesetzten Nachbarplatz bewegen. Dimere werden an einer Stelle i = 0 mit der Rate \({\bar{k}}_{{{{{{{{\rm{on}}}}}}}}}\) auf das Gitter geladen und mit der Rate gelöst koff. Wir bezeichnen die Wahrscheinlichkeit, dass es n ParB-Dimere an der i-ten Stelle gibt, mit Pn(i, t) (n = 0, 1 aufgrund der Einzelbelegung). Die chemische Hauptgleichung, die diesem Reaktionssystem entspricht, lautet

Unter Verwendung von P0(i, t) + P1(i, t) = 1 können wir dies in Bezug auf die erwartete Anzahl von Dimeren an jeder Stelle umschreiben, \({E}_{i}(t)=\mathop{\ Summe }\nolimits_{n=0}^{1}n{P}_{n}(i,t)={P}_{1}(i,t)\), as

Eine ähnliche Gleichung für Ei(t) wird für ein Multi-Occupancy-Modell erhalten, jedoch mit einem anderen Vorfaktor im Kronecker-Delta-Term71, dh die stationäre Verteilung beider Modelle hat die gleiche Form. Dies lässt sich am einfachsten im Kontinuumslimit (h → 0, d → ∞, \({\bar{k}}_{{{{{{{{\rm{on}}}}}}}}}\ beschreiben. bis \infty\) wobei D = dh2 und \({k}_{{{{{{{{\rm{on}}}}}}}}}={\bar{k}}_{{{{ {{{{\rm{on}}}}}}}}}h\) fest), in dem wir erhalten

Die stationäre Lösung dieser Gleichung lautet

wobei \(\lambda=\sqrt{D/{k}_{{{{{{{\rm{off}}}}}}}}}}\) die zugehörige diffusive Längenskala ist.

Vor der Anpassung an das experimentelle ChIP-seq-Profil haben wir das Profil zunächst mit einer Auflösung von 20 bp gruppiert, um es an die Simulationen anzupassen. Wir passen dann die rechte Seite des äußersten rechten Peaks des experimentellen Profils (Abb. 3d) an eine Exponentialfunktion y = aex/λ an, wie aus der obigen Analyse erwartet. Wir verwenden die MATLAB-Anpassungsfunktion, um den Längenskalenparameter λ anzupassen, für den wir λ = 710 bp finden. Die obige Analyse zeigt, dass \(\lambda=\sqrt{\frac{D}{{k}_{{{{{{{\rm{off}}}}}}}}}}}\) und wir Bestätigen Sie dies numerisch. Wir können daher die aus dem FRAP-Experiment erhaltene Schätzung für koff verwenden, um D = 5600 bp2s−1 = 6,1 × 10−4 μm2s−1 zu erhalten. Beachten Sie, dass dieser Wert von D keine weiteren Hindernisse berücksichtigt, die über den Effekt der gegenseitigen Verschiebung der ParB-Dimere hinausgehen. Der verbleibende Parameter des Gleitmodells ist der Gesamtfaktor der Belastungsraten, kon. Dies wird bestimmt, indem die beste Anpassung des stochastischen Modells an das gesamte ParB-Bindungsprofil ermittelt wird, die durch den mittleren quadratischen Fehler zwischen dem ChIP-Seq-Profil und dem aus den Simulationen erhaltenen Steady-State-Profil bestimmt wird (ergänzende Abbildung 3c). Beide Profile werden auf die gleiche Fläche unter der Kurve normiert, bevor der mittlere quadratische Fehler berechnet wird.

Für die Roadblock-Simulationen haben wir das gleiche Framework verwendet, jedoch mit einer einzelnen parS-Site, und eine hohe Laderate kon = 100 gewählt, sodass diese Site die meiste Zeit belegt ist. Wir verwenden die Werte von D und koff wie oben. Ein Roadblock wird als weiteres Partikel implementiert, das an eine bestimmte Stelle 25 Gitterplätze (500 bp) von der parS-Stelle entfernt binden und sich von ihr lösen kann.

Um die Auswirkung der Straßensperre zu untersuchen, legen wir entweder (1) die Entbindungsrate kR,off so fest, dass die Residenzhalbzeit (\(\tau=\log (2)/{k}_{{{{{{{{ \rm{R,off}}}}}}}}}\)) der Straßensperre konstant bleibt und dann die Bindungsrate kR,on variiert, um die Belegung der Straßensperre zu variieren, oder (2) die Belegung (kR, on/(kR,on + kR,off)) der Straßensperre und variieren sowohl kR,on als auch kR,off um denselben Faktor.

In den gekoppelten Simulationen hängt die Verbrückungswahrscheinlichkeit von den tatsächlichen Positionen der gleitenden ParB-Dimere auf dem Polymer ab. Verbrückte ParB-Dimere diffundieren aufgrund der topologischen Einschränkungen durch die Bindung an distale DNA-Regionen nicht entlang der DNA. Überbrückte Dimere wirken daher als Hindernisse für die nicht überbrückten Dimere und verhindern, dass sie vorbeigleiten. Wir halten das Polymer auf der gleichen Länge wie zuvor (500 Monomere), fügen jedoch an jedem Ende weitere 250 Gitterplätze hinzu, über die auch gleiten darf. Dies bietet eine ausreichende Länge, um seltene, weit diffundierende ParB-Dimere zu berücksichtigen, bevor sie dissoziieren.

Die Parameter stammen aus den vorherigen Simulationen: p beträgt entweder 40 oder 4 × 103 s−1 für den strukturierten bzw. globulären Bereich und die ParB-Entbindungsrate \({k}_{ub}=\frac{{ {{{{\rm{log}}}}}}(2)}{64}{s}^{-1}\) und die gesamte ParB-Laderate kon = 200 ⋅ koffs−1. Der Diffusionskoeffizient aus dem Gleitmodell kann aufgrund der Blockadewirkung der Brücken nicht verwendet werden. Daher wird es zusammen mit der Überbrückungsrate kb so gewählt, dass es am besten zum ChIP-seq-Profil passt und gleichzeitig zum beobachteten Kondensationsgrad führt (78 nm ParB-Radius). Eine Erhöhung des Diffusionskoeffizienten über einen bestimmten Punkt hinaus hat keine Auswirkung, da gleitende ParB-Dimere zwischen Brücken einen stationären Zustand erreichen.

Die Simulation wird durchgeführt, bis ein stationärer Zustand erreicht ist, der durch das vom Polymer eingenommene Volumen bestimmt wird, bevor eine Momentaufnahme erstellt wird. Für jeden getesteten Parametersatz werden 1000 Simulationen durchgeführt, jede mit einer anderen Ausgangskonformation.

Das Modell, das der aktuellen Arbeit am nächsten kommt, ist das Ausbreitungs- und Überbrückungsmodell20. Dieses Gleichgewichtsmodell zeigte, wie ParB die zentromere Region durch eine Kombination aus Brückenbildung und Wechselwirkungen mit nächsten Nachbarn verdichten kann. Zu diesem Zeitpunkt war nicht bekannt, dass ParB eine DNA-Klemme ist und das Modell beruhte daher auf der Bindung von ParB an unspezifische DNA. Während das Modell nominell die Steifheit der DNA berücksichtigte, erlaubte das verwendete Polymermodell nur Bindungswinkel von 0∘ oder 90∘ und war daher wahrscheinlich nicht in der Lage, das Zusammenspiel zwischen ParB-Brücken und Steifigkeit, das wir in unserem Modell beobachten, vollständig zu erfassen. Das Keimbildungs- und Käfigmodell11,21 kann nicht direkt mit unserem verglichen werden, da es ParB nicht explizit modelliert, sondern es als eine feste räumliche Verteilung behandelt, die auf der parS-Stelle zentriert ist. Es wurde vermutet, dass dies ein Ergebnis der ParB-Selbstorganisation aufgrund von Selbst- und unspezifischen DNA-Wechselwirkungen zusammen mit der Keimbildung an der parS-Stelle ist (später als Flüssig-Flüssig-Phasentrennung beschrieben43). Im Gegensatz zu unserem Modell hatte ParB keinen Einfluss auf die DNA (Brücken wurden nicht berücksichtigt), die als Gaußsches Polymer modelliert wurde. Während dieses Modell eine unphysikalisch kurze Persistenzlänge erforderte, um das ChIP-Seq-Bindungsprofil zu erklären, wurde dieses Problem anschließend durch Einbeziehung des Effekts der DNA-Supercoiling22 gelöst.

Der C. crescentus-Stamm MT174 (parB::egfp-parB)72 wurde in M2G-Minimalmedium73 bei 28 °C und 220 U/min 36 Stunden lang bis zu einer OD600 von ~0,6 gezüchtet. Die Zellen wurden auf Pads aus 1 % (Gew./Vol.) Agarose in M2G-Medium getupft. Die Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Imager.Z1-Mikroskop aufgenommen, das mit einem Zeiss Plan Apochromat 100x/1,46 Oil DIC-Objektiv und einer pco.edge 4,2 sCMOS-Kamera (PCO) ausgestattet war. Zur Fluoreszenzdetektion wurden eine X-Cite 120PC-Metallhalogenid-Lichtquelle (EXFO, Kanada) und ein ET-EGFP-Filterwürfel (Chroma, USA) verwendet. Die FRAP-Analyse wurde durchgeführt, indem einzelne EGFP-ParB-Foci mit einem 488-nm-Festkörperlaser und einem 2D-VisiFRAP-Mehrpunkt-FRAP-Modul (Visitron Systems, Deutschland) mit 2-ms-Impulsen/Pixel bei 20 % Laserleistung gebleicht wurden. Nach der Aufnahme eines Vorbleichbildes und der Anwendung eines Laserpulses wurden 16 Bilder in 20-s-Intervallen mit VisiView 4.0.0.14 (Visitron Systems) aufgezeichnet. Für jeden Zeitpunkt wurden die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten gleich großer Regionen, die den gebleichten Fokus, den nicht gebleichten Fokus, den Zellhintergrund und einen Referenzbereich des Agarosekissens enthielten, unter Verwendung von Fiji 1,4974 bestimmt. Nach Hintergrundkorrektur, Normalisierung und Mittelung der Fokusintensitäten wurde die Erholungshalbwertszeit durch Anpassen der Daten wie unten beschrieben berechnet.

Um die Verweilzeit von ParB-Dimeren aus der Photobleichung zu berechnen, führen wir eine einfache Manipulation der Daten durch. Nach der in43 verwendeten Standardberechnung können die FRAP-Experimente durch ein einfaches kinetisches Modell für die ParB-Proteine ​​im Partitionskomplex und das ParB im restlichen Zytoplasma beschrieben werden. Unter Berücksichtigung von B1(t) und B2(t) als durchschnittliche Anzahl von ParB-Proteinen in jedem Partitionskomplex nach der Photobleichung, Btot als Gesamtzahl von ParB-Dimeren und kin und kout als Geschwindigkeit, mit der in die Partitionskomplexe ein- bzw. ausgetreten wird, kann das System Folgendes tun geschrieben werden als:

Um die Daten leichter anzupassen, betrachten wir die Summe und Differenz, B± = B1(t) ± B2(t):

Die allgemeine Lösung dieser Gleichungen ist gegeben durch:

Eine einfache exponentielle Anpassung unserer Daten an die Differenzkurve (ergänzende Abbildung 3b) ergibt kout = 0,011 s−1 oder eine Halbwertszeit im Fokus von 64 s und B−(0) = 0,91. Wenn wir dann die Summe anpassen und B∞ gleich 0,62 annehmen, finden wir B+(0) = 1,06 und kin = 0,0035 s−1. Mit diesen angepassten Werten können wir B1(t) und B2(t) in Abb. 3c darstellen, indem wir die einfache Transformation \({S}_{1}=\frac{1}{2}({S}_{+} +{S}_{-})\) und \({S}_{2}=\frac{1}{2}({S}_{+}-{S}_{-})\).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die aus dem Polymermodell generierten Datensätze finden Sie unter https://gitlab.gwdg.de/murray-group/kBFM/-/tree/bridging_prob und die aus dem gekoppelten Bridging- und Sliding-Modell generierten Datensätze unter https:// gitlab.gwdg.de/murray-group/kBFM/-/tree/Coupled. Die Zugangsnummer für die ChIP-seq-Daten lautet GSE10023312. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Code für die Polymersimulation ist unter https://gitlab.gwdg.de/murray-group/kBFM/-/tree/bridging_prob verfügbar. Code für die Gleitsimulation ist unter https://gitlab.gwdg.de/murray-group/Caulobacter_ParABS/-/tree/Caulo_20bp verfügbar. Code für die gekoppelte Polymer- und Gleitsimulation ist unter https://gitlab.gwdg.de/murray-group/kBFM/-/tree/ Coupled verfügbar.

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Wir danken Jean–Charles Walter (Montpellier) für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft gefördert.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie und Zentrum für Synthetische Mikrobiologie, 35043, Marburg, Deutschland

Lara Connolley, Martin Thanbichler und Seán M. Murray

Fachbereich Biologie, Universität Marburg, 35043, Marburg, Deutschland

Lucas Schnabel & Martin Thanbichler

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SMM hat das Projekt konzipiert. SMM und LC führten die rechnerische Modellierung und Analyse durch. MT und LS führten die FRAP-Experimente durch. SMM und LC haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Seán M. Murray.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Connolley, L., Schnabel, L., Thanbichler, M. et al. Komplexe Partitionsstrukturen können durch Gleiten und Verbrückung von ParB-Dimeren entstehen. Nat Commun 14, 4567 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40320-y

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Eingegangen: 21. Dezember 2022

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 29. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40320-y

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